Résonance magnétique nucléaire

La résonance magnétique nucléaire, aussi dénommée par son application la plus connue l'imagerie par résonance magnétique, est une technique de chimie analytique...


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Physique quantique - Spectroscopie - Mesure physique - Métrologie - Résonance magnétique nucléaire

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  • 5-SPECTROMETRIE DE RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE (RMN)... Dans un champ magnétique de 10000 Gauss (Bo), les protons résonent à une fréquence particulièrement proche... (source : snv.jussieu)

La résonance magnétique nucléaire (RMN), aussi dénommée par son application la plus connue l'imagerie par résonance magnétique (IRM), est une technique de chimie analytique et structurale non destructive particulièrement utilisée en physique (études de matériaux), chimie ou biochimie (structure de molécules) et pour l'imagerie médicale. C'est une technique de spectroscopie applicable aux particules ou ensembles de particules qui ont un spin nucléaire non nul.

Les physiciens Bloch et Purcell reçurent le prix Nobel de physique en 1952[note 1] pour leurs applications spectrométriques et d'imagerie[1]. En 1970, ces mêmes techniques de spectrométrie RMN ont été appliquées à l'imagerie médicale (zeugmatographie) grâce au développement de l'informatique et la rapidité de calcul des processeurs vectoriels et l'utilisation de la FFT.

Dans le phénomène de RMN, un noyau atomique absorbe le rayonnement électromagnétique à une fréquence spécifique, caractéristique du noyau reconnu, en présence d'un fort champ magnétique. Rabi a découvert ce phénomène en 1938. La résonance magnétique a été ensuite appliquée à la détection des atomes légers tel que l'hydrogène.

Un spectromètre à RMN

Principe

La RMN exploite une propriété spécifique des particules quantiques qu'on nomme le spin. Toute particule possède un spin dont l'effet est comparable à celui d'un moment magnétique (c. -à-d. une sorte de petit aimant). Il en résulte qu'un champ magnétique extérieur peut interagir avec le moment magnétique de spin, légèrement comme le champ magnétique terrestre fait tourner l'aiguille d'une boussole.

Le spin du noyau d'un atome ou spin nucléaire dépend de son nombre de protons et de neutrons : les atomes dont les noyaux sont composés d'un nombre pair de protons et de neutrons possèdent un spin nul. Ainsi, les atomes de carbone (qui possède 6 protons + 6 neutrons sous sa forme isotopique la plus stable, dite carbone 12) et d'oxygène 16 (8 protons et 8 neutrons) sont particulièrement répandus mais leur spin nucléaire est nul. Par contre, d'autres noyaux ont un spin nucléaire différent de zéro, on va par conséquent pouvoir interagir avec eux en RMN. A titre d'exemple, le noyau de l'hydrogène n'est composé que d'un seul proton, le moment magnétique nucléaire de l'hydrogène est par conséquent celui du proton isolé, à savoir s = 1 / 2. Or comme l'hydrogène est un élément particulièrement répandu, la résonance magnétique de l'hydrogène (dite aussi RMN du proton) est la plus utilisée mais on exploite aussi fréquemment la RMN du carbone 13 ou le deutérium (2H). Il est surtout important de faire remarquer que l'adjectif nucléaire employé ici n'a aucun rapport avec les phénomènes de radioactivité, mais fait juste référence au noyau atomique.

La physique quantique nous apprend qu'un moment magnétique de spin 1/2 positionné dans un champ magnétique extérieur possède deux niveaux d'énergie envisageables. La RMN consiste à modifier le moment magnétique nucléaire, c'est à dire à faire passer le noyau d'un niveau d'énergie à un autre, en appliquant des champs magnétiques à l'échantillon qu'on veut étudier. Quand l'énergie des photons qui forment ces champs magnétiques correspond à l'énergie de transition d'un niveau d'énergie à l'autre, ces photons peuvent être absorbés par le noyau : il y a alors résonance. De façon imagée, on peut se représenter la résonance comme si les photons faisaient «basculer» le spin du noyau d'une orientation à une autre.

Comme l'énergie des photons d'un champ électromagnétique est directement dépendante de la fréquence de ce champ, on peut caractériser l'énergie de transition du moment magnétique de spin nucléaire en donnant la fréquence de l'onde électromagnétique qui permet la résonance. On parle par conséquent de fréquence de résonance. Pour les champs usuels (de l'ordre du tesla), la résonance du proton a lieu dans le domaine des ondes radio (100 MHz à peu près)  : 42 MHz dans un champ de 1, 0 T et 63 MHz dans un champ de 1, 5 T.

La relation mathématique existant entre le champ magnétique imposé de norme B0 et la fréquence de résonance (retournement de spin) ν0 est particulièrement simple (voir ci-dessous pour la démonstration)  :

\nu_{0} = \gamma\times {B_{0} \over 2\pi}

γ est le rapport gyromagnétique caractéristique de chaque noyau étudié.

Ainsi le tableau suivant donne les valeurs de γ pour les noyaux les plus courants

Noyau Spin Net γ / 2π (MHz/T)
1H 1/2 42, 58
31P 1/2 17, 25
14N 1 3, 08
13C 1/2 10, 71
19F 1/2 40, 08

On voit mais aussi la fréquence de l'onde électromagnétique indispensable pour la résonance du proton est à peu près 4 fois plus élevée que celle indispensable pour la résonance du 13C.

La transition du spin vers son retour à l'équilibre (la relaxation) entraîne l'émission d'une onde électromagnétique qui peut être détectée par un capteur.

Modélisation physique de la résonance magnétique nucléaire

L'excitation par les champs magnétiques

Quand un proton est soumis à un champ magnétique externe tel que B0, il aura tendance à s'orienter dans la direction de ce dernier ; mais, contrairement aux aimants à mémoire permanente, les protons ne vont pas tous s'orienter dans le même sens (nord-sud et sud-nord) en tournant autour de B0 avec un certain angle de précession. Les deux populations ainsi constituées vont se répartir de façon soit parallèle (dans le même sens que B0) soit anti-parallèle (dans le sens contraire de B0) [note 2].

Le phénomène de résonance magnétique peut être abordé selon deux modèles :

Le modèle classique
La précession d'un proton soumis au champ magnétique B0.

En mécanique classique, la description du phénomène de résonance magnétique permet en premier lieuer les notions de «double» précession. Une notion utile pour comprendre le phénomène de «bascule» du vecteur d'aimantation macroscopique par les RF lors de la résonance.

En absence de champ magnétique externe, les protons d'un échantillon tissulaire sont orientés de façon aléatoire dans l'espace sachant que la somme des vecteurs d'aimantation élémentaire (de chaque proton) microscopique est nulle et il n'y a pas de vecteur d'aimantation macroscopique (M=0). Quand un champ magnétique externe d'intensité significative est appliqué, les protons s'orientent dans sa direction sans être réellement idéalement alignés à ce dernier. En effet, les protons tournent individuellement autour de B0 à une fréquence angulaire (c'est la précession) selon l'équation de Joseph Larmor, où ω0 est la fréquence angulaire de Larmor ou fréquence angulaire de résonance proportionnelle à B0 et γ est le rapport gyromagnétique (spécifique à chaque noyau)  :

\omega_0= \gamma \cdot B_0

Chaque proton décrit un cône autour de B0, comme le ferait une toupie de gravitation terrestre (En réalité le proton décrit un double cône dont les sommets se rejoignent en son centre de gravité) selon leur sens parallèle (basse énergie) ou anti-parallèle (haute énergie).

La répartition des protons parallèles et anti-parallèles est à peu près équivalente. Cependant, il y a légèrement plus de protons parallèles que de protons anti-parallèles, mais cette différence, si infime soit elle (pour un B0 = 0, 5 tesla ainsi qu'à à peu près 37 °C sur 1 000 002 de protons d'hydrogène il y a 500 002 protons parallèles), suffit beaucoup à produire un signal RMN à l'échelle tissulaire qui sera l'origine de la formation d'une image. Plus l'intensité du champ magnétique principal est grande plus la différence entre protons parallèles et anti-parallèles est grande et par conséquent plus la quantité de signal est élevé.

Les protons parallèles surnuméraires vont être à l'origine de la formation d'un vecteur d'aimantation macroscopique M. À l'état d'équilibre, ce dernier est aligné sur B0 sans aimantation transversale mais en précession autour de cet axe (appelé par convention Mz) avec un angle donné. Ce phénomène de précession fait apparaitre une nouvelle composante longitudinale Mz (aimantation longitudinale)  ; à l'équilibre cette aimantation est nommée M0z : Les précessions protoniques ne sont pas cohérentes ; pour un temps T donné et précis, les précessions sont dans différentes directions. On dit que les protons sont "déphasés" : il n'y a pas de composante transversale Mxy résultante. M0z croît avec la concentration en protons par unité de volume (c'est la densité protonique) et avec la force du champ magnétique principal.

Il est impossible, à cette étape, de mesurer le vecteur d'aimantation macroscopique : ce dernier étant dans le même sens et la même direction que B0, son signal est noyé dans celui du champ principal.
Pour pouvoir le mesurer, il va falloir trouver un moyen de le discriminer du champ magnétique principal, en le basculant dans le plan xOy par un deuxième champ magnétique dit "tournant" : B1 ou onde de radiofréquence (RF).

Le champ électromagnétique B1 est appliqué dans le plan xOy selon l'axe Ox. Pour qu'il y ait transfert d'énergie à ce dispositif en état d'équilibre il faut que la fréquence de rotation ωr des ondes de radiofréquence soit synchrone à la fréquence de Larmor \omega_0= \gamma \cdot B_0 spécifique des protons dans le champ donné B0 : on dit tandis que les deux dispositifs sont en résonance (ω0 = ωr).

Lors de l'application du second champ magnétique le vecteur macroscopique M continue d'être en précession autour de Bo à la fréquence angulaire ω0.
Il se met aussi en précession autour de B1 à la fréquence angulaire ω1.

Dès lors, il y a par conséquent trois fréquences angulaires qui s'appliquent sur les protons :

Rappelons aussi qu'à ce moment (ω0 = ωr) sinon il n'y a pas résonance.

Schéma de l'effet des impulsions de radiofréquence

En imagerie, le champ magnétique tournant (ou onde de radiofréquence) est appliqué pendant un temps particulièrement court de l'ordre de quelques millisecondes (ms) de telle sorte que M bascule d'un angle de 90° ou 180°. Pour mieux représenter cette réalité, on ne parle plus de l'application d'un "champ électromagnétique tournant" mais plutôt "d'impulsion de radiofréquence" ou encore "d'impulsion d'excitation" quoique cela ne change rien à la nature de B1 et qu'on continue à parler de la même chose.

Selon l'angle de bascule de M génèré par l'onde RF et par convention, on parlera d'impulsion de 90° ou impulsion à 180°.

Schéma de l'effet d'une impulsion à 90°

Dans une impulsion à 90° :

Dans une impulsion à 180° :

La durée de l'impulsion est directement proportionnelle à l'angle de bascule de M, ainsi on sait que T/4 pour une impulsion à 90° et T/2 pour une impulsion à 180° où T est la période de l'impulsion (une période T correspond au temps indispensable à l'onde RF pour effectuer une bascule de 360° de M). Il faut par conséquent deux fois plus de temps pour une impulsion à 180° que pour une impulsion à 90°.

Dès la fin de l'excitation, le vecteur M va retourner à l'état d'équilibre, tout en demeurant en précession autour de B0, avec diminution rapide de la composante transversale Mxy : C'est ce qu'on appelle les phénomène de relaxation. On parlera séparément de relaxation transversale et de relaxation longitudinale qui correspondent aux deux types d'aimantation tissulaire Mz et Mxy qui sont soumis à des mécanismes d'apparition et de disparition bien différents. Ceux-ci sont expliqués par le modèle quantique.

Le modèle quantique

Le modèle quantique permet une autre approche des mécanismes de la RMN qui est indispensable à la compréhension des phénomènes de relaxation.

Les protons soumis à un champ magnétique externe ne peuvent présenter que deux orientations de spin : la parallèle et l'anti-parallèle. Par convention, on dit que le proton a un spin 1/2.

Comme énoncé brièvement plus haut, les deux conformations parallèle et anti-parallèle correspondent à deux niveaux d'énergie :

(où h est la constante de Planck)

L'énergie du proton parallèle est moins élevée que celle du proton anti-parallèle. La différence énergétique ΔE = E1E2 est proportionnelle à B0 \left(\Delta_E=\gamma \cdot \frac{h}{2\pi} \cdot B_0\right) Elle est trois fois plus élevée dans un champ de 1, 5 Tesla que dans un champ de 0, 5 Tesla.

Cette différence énergétique est mise à profit en IRM. Comme nous l'avons vu auparavant, le vecteur d'aimantation ne pouvait être récupéré car dans les mêmes sens et direction que le champ magnétique principal B0. Il fallait utiliser un champ magnétique tournant pour basculer ce vecteur et le rendre détectable. Nous tenterons ci-dessous de comprendre par quels phénomènes cette "bascule" a lieu.

Il est envisageable d'induire des transitions du niveau E1 au niveau E2 (et par conséquent de modifier l'orientation de M) en induisant une onde de radiofréquence qui apportera une quantité énergétique précisément égale à ΔE
Cette quantité d'énergie E est directement proportionnelle à la fréquence des RFs, par conséquent pour que E = ΔE il faut quoique Vr=V0 ou que ωr = ω0.

Les ondes de radiofréquence sont appliquées sous forme d'impulsions, c'est par conséquent pendant ces courts laps de temps que vont se produire les transitions de protons du niveau de basse énergie E1 vers un niveau de haute énergie E2 (les protons parallèles s'orientent alors en anti-parallèles).
Quand la moitié des protons surnuméraires est passé en anti-parallèle, il y a égalisation des populations de haute et de basse énergie : c'est ce qu'il se produit lors d'une impulsion à 90° (voir sections ci-dessus). Par contre lors d'une impulsion à 180°, c'est la totalité des protons surnuméraires qui passent en anti-parallèle il y a par conséquent inversion des populations. Lors de cette opération on observe par conséquent la formation et la modification de la composante longitudinale de M (Mz) , mais ceci n'explique pas la naissance de la composante transversale de M.

Dans les sections précédentes, il a été remarqué que les spins des protons soumis à un champ magnétique étaient déphasés, c'est-à-dire qu'ils se mouvaient de manière anarchiques. Cependant quand les protons changent d'orientation, sous l'impulsion des ondes de radiofréquence, il y a mise en phase des uns comparé aux autres. Ce phénomène entraîne la naissance macroscopique d'une composante transversale de M (Mxy) .

Les phénomènes de relaxation

Dès la fin de l'excitation, il va y avoir un retour à l'état d'équilibre.

D'une part par une réapparition (repousse) progressive de l'aimantation longitudinale Mz (relaxation T1) et par une disparition rapide de l'aimantation transversale Mxy (relaxation T2) . C'est par la relaxation des protons que le phénomène de résonance magnétique nucléaire devient détectable.

Soit :

La relaxation longitudinale ou T1

La relaxation se fait exponentiellement. Si M0 est la valeur à l'équilibre de l'aimantation longitudinale et supposons que l'aimantation d'origine est nulle (après une impulsion électromagnétique de π/2), on peut écrire :

M (t) =M0 [1-exp (-t/T1) ]

On voit qu'après un temps suffisamment grand, le moment retourne à sa valeur d'équilibre.

La relaxation transversale ou T2

Historique

Utilisations

Le caractère non destructif de cette technique analytique a conduit à divers développements de cette méthode qui est désormais employée en médecine pour étudier le corps humain (IRM), ou en chimie organique pour réaliser des analyses structurales.

C'est un outil de biophysique particulièrement utilisé en génomique structurale pour obtenir une'image'en 3D des molécules du vivant.

La RMN en chimie organique

Spectromètre RMN 200 MHz avec passeur automatique d'échantillons utilisé en chimie organique pour la détermination des structures chimiques.

La RMN est l'outil d'analyse aujourd'hui le plus utilisé en chimie organique. Elle permet d'obtenir des informations qualitatives ou quantitatives sur l'échantillon analysé, suivant la technique employée. Les noyaux les plus fréquemment étudiés sont le 1H, le 13C, le 17O, le 31P et le 19F qui présentent, pour la majorité, un spin nucléaire non nul égal à 1/2. Le 14N quant à lui présente un spin nucléaire égal à 1 alors que celui de l'oxygène est de 5/2.

L'échantillon à analyser est mis en solution dans un solvant deutéré (voir 2D, un isotope de l'1H présentant un spin nucléaire égal à un). Ce solvant, le plus souvent du chloroforme deutéré, (CDCl3) est normalement invisible en RMN du proton, puisque le deutérium a une fréquence de résonance bien différente de celle de l'hydrogène (le rapport gyromagnétique vaut 6, 54 MHz/T dans le cas du Deutérium).

Considérons la RMN du 1H : l'environnement chimique des atomes d'hydrogène qui sont reliés chimiquement aux molécules de l'échantillon influent sur la fréquence de résonance de ceux-ci ; ainsi, l'hydrogène d'un groupement alcool (-OH) aura une fréquence de résonance ν1 supérieure à celle de l'hydrogène d'un groupement carboxyle (-COOH) ν2. Comme la différence entre ces deux fréquences est de quelques hertz, les chimistes ont défini une autre grandeur : le déplacement chimique (chemical shift), et se réfèrent à une fréquence de retournement de spin étalon, celle du tétraméthylsilane (TMS), qu'on introduit dans l'échantillon.

La relation entre la fréquence de résonance de l'échantillon ν1 et le déplacement chimique correspondant δ1 est donnée par le calcul suivant :

\delta_1 = 1000000 \times (\nu_1 - \nu_{TMS}) / \nu_{appareil}

Dans les cas cités, le déplacement chimique vaut à peu près 4 pour RO-H, et 11 pour R-COO-H.

La RMN du 1H peut être assez rapide (ordre d'idée : 2 min) et permet une analyse quantitative aisée. Grâce à l'interprétation de la nature des massifs obtenus (multiplets) ainsi qu'à la connaissance empirique des déplacements chimiques des protons présents dans chaque groupement fonctionnel, il est envisageable de déterminer la structure développée de l'ensemble des molécules organiques par application d'un raisonnement logique simple.

La RMN du 13C sert à retrouver l'ensemble des carbones de la molécule grâce, là aussi, à la connaissance empirique des déplacements chimiques des carbones faisant partie de divers groupements fonctionnels. Les appareils récents permettent d'obtenir rapidement les spectres RMN 1H et 13C, ceux-ci avec ou sans découplage du proton.

Spectres issus de RMN 1D

RMN du proton

Si on connait la molécule associée à un spectre, on peut trouver le nombre de massifs attendus en cherchant des éléments de symétrie qui échangent des protons (chiralité ou non de la molécule), tels que des axes, plans ou centres d'inversion.

Pour interpréter un spectre, il faut tenir compte de trois éléments pour chaque massif :

L'intégration donne le nombre d'hydrogènes en jeu pour chaque signal, elle est indiquée sur le spectre ou il faut la calculer avec "vagues d'intégration", si on connait le nombre total d'hydrogènes présent.

Le nombre de raies de chaque massif donne des informations sur le nombre d'hydrogènes couplés. Les hydrogènes non couplés donne un singulet (pic unique), par exemple ceux liés à un oxygène d'une fonction alcool. Les hydrogènes couplés à 1 proton donnent un doublet sur le spectre, ceux couplés à 2 protons donne un triplet (intensités des raies en 1/2/1) et ceux couplés à trois protons donneront un quadruplet : 4 raies d'intensités 1/3/3/1. Il est bon de calculer la constante de couplage (écart entre 2 raies) en Hertz qui donne quelquefois des indices précieux.

Le déplacement chimique, en ppm, se lit sur l'axe des abscisses et est lié au blindage. L'utilisation de tables de déplacement chimique est utile pour trouver les enchainements d'atomes présents dans la molécule. Il est aussi intéressant de connaître l'importance des effets inductifs et mésomères sur ce déplacement chimique

Exemple :

specte RMN
spectre RMN 1H de l'éthanol

On observe 3 massifs :

Note : l'intégration n'est pas visible sur ce spectre

A donne : -CH2-CH3

C donne : -CH2-CH3

et on trouve un hydrogène non couplé (B) qui est par conséquent lié à l'oxygène

Une table de déplacements chimique nous apprend que les H liés à des Carbones en alpha d'une fonction alcool donnent un signal vers 3.4-4 ppm [2] ce qui est cohérent avec les 3.8 ppm du massif A.

On retrouve la structure de l'éthanol en analysant sommairement le spectre 1H associé. Il s'agit néanmoins d'une molécule simple et l'ensemble des spectres ne s'analysent pas aussi aisément (couplage du 2e ordre envisageable, présence de certains hétéroatomes, d'isotopes, constantes de couplages proches, résolution médiocre et la présence de plusieurs dispositifs de spin peuvent compliquer l'analyse).

RMN du carbone 13

Il y a plusieurs spectres envisageables, selon la séquence programmée :

On trouve par exemple des spectres sans découplage hétéronucléaire (peu courants)  : cela donne des massifs dont le nombre de raies sert à connaitre le nombre d'hydrogènes que porte chaque carbone. On obtient un quadruplet (raies d'intensités 1/3/3/1) pour les CH3, un triplet (1/2/1) pour les CH2, un doublet (1/1) pour les CH et un singulet (pic unique) pour les carbones quaternaires.

En général ce couplage n'est pas pertinent et on découple pendant toute la séquence ou uniquement une partie. Concrètement on obtient un pic par carbone, sauf si la molécule présente des symétries. Il faut se rappeler pour interpreter ces spectres qu'on ne peut pas faire de quantitatif, sauf lors des expériences d'"Inverse Gated Decoupling". Il n'y a pas d'intégration des massifs.

Des séquences plus complexes sont fréquemment utilisés et permettent de repérer le nombre d'hydrogènes liés à chaque carbone. En expérience de Spin écho J-modulée, les pics positifs sont à associer à des CH ou CH3, alors que les pics négatifs impliquent des CH2 ou des carbones quaternaires. Ces sens positifs ou négatifs ne sont qu'une convention, on peut tout à fait prendre l'opposé si on le précise. Cette expérience sert à faire deux groupes de carbones.

Pour trancher, la séquence DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) est employée, plus exactement le DEPT 90 (intensités nulles sauf pour les pics associés aux carbones CH2) et DEPT 135 (intensités nulles pour les carbones quaternaires, positives pour les CH et CH3, négatives pour les CH2) [3].

Vous pouvez facilement déterminer le type de chaque carbone en combinant les résultats de ces expériences. Il existe des tables de déplacements chimiques pour la RMN du carbone 13 mais il faut se méfier à cause de certains effets qui, en se cumulant, peuvent faire que les déplacements donnés ne soient plus pertinents.

La RMN impulsionnelle

Les premières méthodes utilisées étaient soit de garder le champ magnétique constant et de balayer les fréquences, soit de garder la fréquence constante et de balayer le champ magnétique. Ces méthodes étaient longues car nécessitaient le relevé de la plupart de mesures. La RMN impulsionnelle sert à gagner énormément de temps. Une impulsion électromagnétique extrêmement brève et intense est envoyée sur l'échantillon. Or plus une impulsion est brève, plus son spectre est large. Ce sont par conséquent l'ensemble des noyaux qui vont être stimulés en même temps. Il suffit par conséquent de récupérer le signal réémis par l'échantillon et de le décomposer en fonction simple grâce à des séries de Fourier. De cette manière, on extrait le spectre RMN après un traitement mathématique mais en n'ayant fait qu'une mesure.

Cette méthode est fréquemment schématisée par une ressemblance avec un diapason de musicien : pour trouver la fréquence de résonance du diapason (la note de musique pour laquelle il sert de référence, le plus commun étant le La 440 à 440Hz), on a deux choix :

La RMN impulsionnelle correspond à cette deuxième méthode.

La RMN en imagerie médicale et biophysique

IRM encéphalique (coupe sagittale passant par la ligne médiane)
Article détaillé : imagerie par résonance magnétique.

L'imagerie par résonance magnétique nucléaire (IRM) est une technique d'imagerie médicale permettant d'avoir une vue 2D ou 3D d'une partie du corps. Cette technique est particulièrement utile pour l'observation du cerveau. Grâce aux différentes séquences (séquence IRM), on peut observer différents tissus avec des contrastes particulièrement élevés car la résolution en contraste est nettement meilleure que celle du scanner.

La RMN en informatique quantique

La RMN en biologie structurale

À côté de la radiocristallographie, la RMN est devenue une méthode d'étude des macromolécules biologiques en solution. Elle ne nécessite pas l'obtention de monocristaux et permet d'étudier des protéines, des acides nucléiques à des concentrations millimolaires. Les techniques de RMN multidimensionnelles amènent à corréler les fréquences de plusieurs spins et de résoudre les ambiguïtés liées aux superpositions spectrales. Des protéines de masse moléculaire de 10 à 30 kDa peuvent être analysées mais aussi des oligonucléotides de plusieurs dizaines de paires de bases.

Spectromètre RMN 800 MHz utilisé en biologie structurale.

RMN homonucléaire sans marquage isotopique

Historiquement, les protéines ont été étudiées par la RMN du proton (isotope 1H) présent en abondance.

Une première étape consiste à attribuer les résonances, c'est-à-dire à établir une corrélation entre les signaux du spectre et les atomes d'hydrogène de la molécule. Deux expériences clefs sont utilisées, l'expérience de corrélation par les couplages scalaires (HOHAHA ou TOCSY) et l'expérience de corrélation à travers l'espace par effet Overhauser (NŒSY). Cette attribution est dite séquentielle, car elle opère par positionnement relatif d'un noyau comparé à ses voisins en utilisant l'information de la séquence peptidique. Ce processus d'attribution (comparable à un puzzle) devient de plus en plus complexe à mesure que la taille de la protéine augmente; qui plus est , l'effet Overhauser se transmet à travers l'espace et ne permet pas de distinguer des noyaux proches dans la séquence peptidique et ceux proches dans l'espace. Des erreurs sont par conséquent envisageables qui ne se détectent qu'à la fin du processus, quand certaines pièces du puzzle restent sur le tapis.

Une fois les spectres attribués, les informations sont alors utilisées de manière quantitative : les couplages scalaires renseignent sur les angles dièdres et les effets Overhauser sur des distances interatomiques (jusqu'à 4-6 angströms). Ces informations sont introduites dans des programmes de modélisation moléculaire pour rechercher une ou plusieurs conformations de la molécule compatibles avec les données. La stratégie est comparable à celle du géomètre qui mesure des distances et des angles entre bâtiments et recalcule un plan de ville. Sauf que la portée des distances mesurées en RMN est faible comparé aux objets évalués; l'accumulation des erreurs expérimentales et/ou le faible nombre de données conduit à des structures localement mal définies.

Deux difficultés limitent la taille des macromolécules étudiables : la complexité des spectres et la largeur individuelle de chaque signal. Si la taille de la protéine double, le nombre de résonances dans le spectre va doubler sans que la dispersion (c'est-à-dire la largeur spectrale) n'augmente. Une solution consiste à recourir à un spectromètre RMN à plus haut champs et par conséquent bien plus coûteux. Si la taille double, la masse moléculaire augmente et la protéine tourne plus lentement sur elle-même par mouvement diffusif. Cela conduit à des signaux plus larges, car la relaxation transversale devient plus performante. L'augmentation du champ magnétique est sans effet et il faut trouver une autre parade au problème (réduction de la viscosité, réduction du nombre de protons voisins…).

RMN hétéronucléaire avec marquage isotopique

Pour résoudre les superpositions spectrales dans les grosses molécules, il s'avérait indispensable de passer de la RMN 2D à la RMN 3D. Des essais peu fructueux ont été faits au début des années 1990 pour combiner les séquences HOHAHA et NŒSY dans une expérience tridimensionnelle. Si on dispose d'une protéine entièrement enrichie en 15N et en 13C, on peut concevoir des expériences de corrélation entre spins, seulement fondées sur des couplages scalaires et servant à relier tout le squelette peptidique mais aussi les chaînes latérales. Les isotopes naturellement abondants sont respectivement le 14N (noyau quadrupolaire) et le 12C (noyau invisible en RMN), mais la majorité des protéines étant obtenues par surexpression bactérienne, il est envisageable de faire des cultures sur des milieux enrichis isotopiquement.

Cette nouvelle stratégie fait appel à une série d'expériences 3D triple résonance : 3D car un spectre tridimensionnel est obtenu, triple résonance car les fréquences de trois noyaux divers sont détectées. Pour des raisons de sensibilité, toutes ces séquences partent du 1H (noyau au rapport gyromagnétique élevé) et se terminent par la détection du même noyau. Dans l'expérience HNCO, on établit par conséquent une corrélation entre le proton amide (HN), son azote (N) et le carbonyle (CO) de l'acide aminé précédent. Les couplages scalaires utilisés pour les transferts de cohérence sont des couplages 1J (à une liaison) et par conséquent assez importants (1JNH = 90 Hz et 1JNCO=15Hz). Cela assure par conséquent une grande efficacité de transfert même dans le cas de protéines de masse élevées (largeur de raie). À noter que cette expérience HNCO sert à relier par couplage scalaire des acides aminés, ce que la stratégie homonucléaire ne permettait pas (absence de couplage scalaire 3J à travers la liaison peptidique)

Notes et références

Notes

  1. En date de 2010, trois prix Nobel ont été attribués à cette découverte
  2. Ceci est dû au fait que les protons n'obéissent pas aux règles "stricto sensu" de la mécanique classique mais aux postulats de la mécanique quantique

Références

  1. (en) «The Nobel Prize in Physics 1952», le prix Nobel de physique 1952 sur le site nobelprize. org
  2. {en} tables de déplacement chimique
  3. {en} DEPT

Voir aussi

Liens externes

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Principaux mots-clés de cette page : protons - magnétique - rmn - champ - résonance - fréquence - impulsions - spin - parallèle - hydrogène - spectres - énergie - conséquent - nucléaire - carbone - noyau - couplage - phénomène - aimantation - chimiques - déplacement - molécules - nombre - onde - relaxation - précession - anti - expériences - autour - vecteur -

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